2021 年 7 月 12 日消息,马里兰州盖瑟斯堡,美国国家标准与技术研究院 (NIST) 的研究人员设计了一种校准方法,使传统显微镜能够在所有三个维度上准确测量样品上光点的位置。为了开发他们的方法,研究人员解决了一个影响几乎所有光学显微镜的问题:镜头像差,并利用像差的影响在整个超广角和深场中精确、准确地跟踪 3D 中的单个发射器。


研究人员使用固有的散光和散焦以及其他像差,在成像基板和复杂的微系统上以 3D 方式定位多个发射器,将他们的概念扩展到六个自由度的运动测量。


校准方法依赖于对研究人员沉积在平面硅晶片上的荧光粒子图像的分析,以校准他们的显微镜。当研究人员分析这些粒子的图像时,他们发现,由于镜头像差,当显微镜沿垂直轴以特定增量上下移动时,图像显得不平衡,粒子的形状和位置似乎发生了变化——即,沿第三维。研究人员进一步发现,即使显微镜在横向平面仅移动几微米或在垂直平面移动几十纳米,镜头像差也会产生较大的图像失真。


研究人员在他们的论文中说:“该分析使研究人员能够准确地模拟透镜像差如何随着垂直位置的变化而改变荧光粒子的外观和明显位置,将粒子不断变化的外观和明显位置校准到其垂直位置,使团队能够成功地使用显微镜测量所有三个维度的粒子位置。”


研究人员设计了一种校准方法,使传统显微镜能够以3D准确测量样品上光点的位置

荧光粒子的图像,从上到下,位于显微镜最佳焦点的垂直位置的上方、上方和下方(左图)。校准透镜像差对粒子图像的表观形状和位置的影响,可以使用普通光学显微镜准确测量所有三个空间维度的位置。跟踪和组合来自微小旋转齿轮上的许多荧光粒子的信息,测试新校准方法的结果,并阐明复杂微系统在所有三个维度上的运动(右),由 NIST 提供


为了测试他们的方法,研究人员使用他们的显微镜对随机沉积在三维旋转的微观硅齿轮上的一组荧光粒子进行成像。研究人员表明,他们的模型准确地校正了镜头像差,使显微镜能够提供有关粒子位置的完整三维信息。


研究人员扩展了他们的位置测量,以捕获齿轮的整个运动范围并完成从系统中提取空间信息。这些额外的测量突出了微系统部件之间纳米级间隙的后果,这些间隙因系统制造的缺陷而异。NIST 研究人员表明,零件之间的纳米级间隙不仅会降低有意旋转的精度,还会导致齿轮无意中摆动、摇摆和弯曲——所有这些都会限制性能和可靠性。


研究人员设计了一种校准方法,使传统显微镜能够以3D准确测量样品上光点的位置


在精度方面,该校准方法在接近 100 Hz 的频率下实现了 25 nm 的轴向精度和 10 µm 的轴向精度,以及 1 nm 的横向精度和 250 µm 的横向范围。即使对于通过光学工程进行校正后可能保留在现代显微镜中的轻微像差,这些值也是正确的。


除了使普通显微镜能够进行 3D 测量外,NIST 开发的校准方法还使显微镜能够更准确地定位物体的位置。它提供了使用普通光学显微镜和简单的定位分析在六个自由度上测量运动的能力,具有准确度和精确度。NIST 团队的方法也不需要重新设计显微镜。


研究人员表示,他们的研究强调了定位显微镜中像差效应的挑战,并将这一挑战重新定义为准确、精确、完整定位的机会。


“与直觉相反,镜头像差限制了二维的准确性,并在三个维度上实现了准确性,”研究人员塞缪尔·斯塔维斯 (Samuel Stavis) 说:“通过这种方式,我们的研究改变了光学显微镜图像维度的视角,并揭示了普通显微镜进行非凡测量的潜力。”


Stavis 指出,镜头像差提供的信息补充了显微镜学家目前用于进行 3D 测量的不太容易获得的方法。NIST 方法有可能扩大 3D 测量的可用性。


研究员克雷格科普兰说:“显微镜实验室可以轻松实施新方法。除了已经存在或正在出现的荧光粒子或类似标准外,不需要额外的设备。用户只需要一个标准样品来测量它们的效果,并需要一个校准来使用结果数据。”


该研究发表在Nature Communications 上。开放获取期刊文章包括演示软件,以指导研究人员如何应用校准。



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