2020年初,新冠病毒(SARS-CoV-2)导致的肺炎疫 情开始在全球大流行,并一直延续至今。遗憾的是,直到今天,新冠疫 情的形势仍然非常严峻。据世界卫生组织(WHO)报告,截至目前全世界范围内超过1.8亿人被感染,累计死亡人数接近400万。


值得注意的是,随着新冠病毒在全球范围内的广泛传播,新的变种病毒不断涌现,包括在英国首先发现的B.1.1.7(现在名为Alpha),首先在南非出现的B.1.351(现在名为Beta),首先在巴西出现的P.1(现在名为Gamma),以及首先在印度出现的B.1.617(现在名为Delta),这些变种病毒往往具有多重变异,并表现出更强的传染性和逃逸免疫能力。


2021年4月23日,印度医学研究理事会(ICMR)的一项研究表明,Delta突变株在S蛋白上具有L452R和E484Q双重突变,并表现出抗体中和反应的下降。


这些研究提醒了我们,在新冠病毒不断变异的大背景下,现有疫苗和治疗性抗体或将逐渐降低效果。因此,迫切需要开发安全有效的预防新冠病毒及其突变株感染的疫苗。


近日,北京大学魏文胜团队在预印本平台 bioRxiv 上发表题为:Circular RNA Vaccines against SARS-CoV-2 and Emerging Variants(抗SARS-CoV-2和新变种的环状RNA疫苗)的研究论文。该研究报告了一种编码新冠病毒刺突蛋白三聚体受体结合域(RBD)的环状RNA疫苗(circRNA-RBD),circRNA-RBD疫苗可以通过体外转录快速生成,且不需要核苷酸修饰,具有高度稳定性。


研究团队通过脂质纳米颗粒(LNP)封装的circRNA-RBD疫苗成功诱导了强有力的持续中和抗体,且该疫苗具有很强的热稳定性,室温下储存2周时间,依然不影响表达。


更重要的是,研究团队利用编码RBD变体(K417N-E484K-501Y)的环状RNA疫苗成功在小鼠体内诱导产生有效中和Beta变异株的抗体,表明环状RNA疫苗在抗击新冠变种病毒上具有十分良好的应用前景。


北大开发可应对新冠突变株的环状RNA疫苗,具有很强的热稳定性


21世纪以来,冠状病毒共引起了三次人畜共患疾病,例如2002-2003年的SARS-CoV,2012年的MERS-CoV以及2019年底爆发的SARS-CoV-2。已有的研究表明,冠状病毒通过表面的刺突蛋白(S蛋白)与宿主细胞表面的受体蛋白ACE2结合,从而介导膜融合和病毒入侵。


S蛋白含有两个亚基——S1和S2,其中S1亚单位C端的受体结合域(RBD)介导新冠病毒入侵宿主细胞,S2亚单位则介导病毒与宿主细胞膜的融合。新冠病毒的S蛋白、S1亚基或RBD抗原均可以诱导B细胞和T细胞反应,产生抗新冠病毒的高效中和抗体。


北大开发可应对新冠突变株的环状RNA疫苗,具有很强的热稳定性


接种疫苗是结束和预防新冠大流行最有希望的方法。目前已应用的新冠疫苗种类众多,包括灭活疫苗、病毒样颗粒疫苗、病毒载体疫苗以及新兴的mRNA疫苗。


新兴的mRNA疫苗,具有生产速度快、成本低,并且能快速应对病毒变异等优点。但与此同时,mRNA疫苗储存和运输条件较为苛刻(-70℃),并具有潜在的免疫原性副作用。


在自然界中,环状RNA(circRNA)普遍存在于真菌、植物、昆虫、鱼类和哺乳动物,甚至于某些病毒的基因组本身就是环状RNA,如D型肝炎病毒和植物类病毒。与线性mRNA不同,环状RNA是高度稳定的,因为它的共价闭合环结构可以保护它免受外切酶介导的降解。


到目前为止,只有少数内源性的环状RNA被证明可以作为蛋白质翻译模板。虽然环状RNA缺乏翻译成蛋白质所必要的元件,但它可以通过内部核糖体进入位点(IRES)或其5'UTR区域的m6A修饰来实现蛋白质翻译。


在这项研究中,研究团队针对新冠病毒及其变种病毒设计了环状RNA疫苗。研究人员利用自我剪接Ⅰ型内含子核酶来产生编码SARS-CoV-2-RBD抗原的环状RNA——circRNA-RBD。为了增强RBD抗原的免疫原性,研究人员将噬菌体T4纤溶蛋白三聚体基序融合到其C端,以此模拟了新冠S蛋白三聚体的自然构象。


北大开发可应对新冠突变株的环状RNA疫苗,具有很强的热稳定性


circRNA-RBD的设计模式图


紧接着,研究团队将纯化后的circRNA-RBD转染到HEK293T细胞中,通过Western blot检测上清液中大量产生新冠病毒的RBD抗原。ELISA定量检测显示RBD蛋白在上清液中达到约143ng/mL,是线性RNA-RBD对照组的50倍。此外,研究人员还进一步证实了circRNA-RBD可以在小鼠NIH3T3细胞中表达。


这些结果表明,circRNA-RBD可以在人和小鼠细胞中大量表达新冠病毒的RBD抗原。


北大开发可应对新冠突变株的环状RNA疫苗,具有很强的热稳定性


相较于线性RNA-RBD,circRNA-RBD的表达量更高


不仅如此,研究人员还使用hACE2过表达HEK293细胞和携带EGFP绿色荧光报告基因的新冠假病毒进行结合竞争实验,以验证由circRNA-RBD产生的RBD抗原是否具有功能。他们发现,分泌的SARS-CoV-2 RBD抗原能有效阻断新冠假病毒感染。


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circRNA-RBD产生的RBD抗原可以有效阻断新冠假病毒感染


在动物实验上,研究团队将脂质纳米颗粒(LNP)包装的circRNA-RBD注射到小鼠体内。研究结果显示,接种了circRNA-RBD疫苗的小鼠的血清可以中和新冠假病毒,且小鼠脾 脏中产生了强烈的T细胞免疫应答。


这些现象表明,circRNA-RBD疫苗确实在小鼠体内诱导了持久的体液免疫应答和强烈的T细胞免疫应答。


研究团队还设计了针对Beta突变株的circRNA-RBD疫苗——circRNA-RBD-501Y.V2,circRNA-RBD-501Y.V2和circRNA-RBD疫苗,Alpha、Beta和Gamma突变株均有效,其中circRNA-RBD-501Y.V2疫苗对Beta突变株具有更高的中和活性。(该研究进行时,Delta突变株尚未出现)。


此外,作者还表示,circRNA还可以用于表达一些其他蛋白质或肽,从而应用于一些罕见疾病或癌症的治疗。


总而言之,这项研究证实,circRNA疫苗具有热稳定性好、编码抗原表达量高以及适用性广泛等优点,并成功设计了相应的circRNA疫苗来对抗新冠病毒及其突变株的感染,表明circRNA疫苗在COVID-19大流行中可以作为一种全新的疫苗和治疗平台。


文章来源: 生物世界

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