哺乳动物的长期亚细胞活体成像对研究天然生理过程中多种细胞间行为和细胞器功能至关重要。然而,光学异质性,组织不透明性和光毒性提出了巨大的挑战。


2021年5月25日,清华大学戴琼海,俞立及范静涛共同通讯在Cell 在线发表题为”Iterative tomography with digital adaptive optics permits hour-long intravital observation of 3D subcellular dynamics at millisecond scale“的研究论文,该研究提出了一种计算成像框架,称为数字自适应光学扫描光场相互迭代层析成像(DAOSLIMIT),它具有高速,高分辨率3D成像,平铺波前校正和紧凑型系统的低光毒性。


通过同时对整个体积进行层析成像,该研究获得了在225×225×16μm3范围内的体积成像,在数十万个时间点上,毫秒级的横向分辨率高达220 nm,轴向分辨率高达400 nm。为了建立功能,该研究探索了中性粒细胞迁移和肿瘤细胞循环过程中不同物种的大规模细胞迁移和神经活动,并观察了哺乳动物的各种亚细胞动力学。


清华大提出了一种计算成像框架,可为数字自适应光学扫描光场相互迭代层析成像


活体器官中的细胞构成了一个精妙的微观世界,在该世界中,细胞和细胞器的可塑性,相互作用和迁移长期以高时空分辨率在多种生理现象中起着至关重要的作用。大量信号和组织成分的参与提供了一个自然的环境,以反映生物过程的自然动力学,这些生物学过程不仅难以在体外或离体重建,而且在观察生物过程中也面临着巨大挑战:例如,心跳和呼吸会引入运动模糊和伪影,而不会产生很高的成像帧速率。组织中折射率的不均匀分布会导致严重的光学像差,从而降低图像分辨率和信噪比。强光剂量会干扰正常的细胞行为和细胞器功能,导致体内成像的光子分别不均。


为了解决这些问题,在过去的十年中,为发展亚细胞活体显微镜(IVM)进行了各种努力,例如旋转盘共聚焦显微镜(SDCM),自适应光学显微镜(AO),高速双光子显微镜和光片显微镜(LSM),促进了动物的神经科学领域,发育生物学,免疫学和癌症生物学的各种研究,但是,在分辨率,速度,SNR和样品健康之间存在不可避免的权衡。在通常需要对多个平面进行轴向扫描的三维(3D)生物中,情况变得更糟。


清华大提出了一种计算成像框架,可为数字自适应光学扫描光场相互迭代层析成像


文章模式图(图源自Cell )


因此,一个实验的时间窗口只能支持数百个体积,以避免总光剂量低于〜300 J / cm2的光损伤。LSM通过仅激发对焦区域来避免不必要的曝光来缓解该问题。带有AO的Lattice LSM(LLSM)进一步提高了透明生物体的时空分辨率,但是小视场(FOV)和平铺AO校正都限制了其在大体积下的速度。此外,由于组织的不透明性和空间限制,很难在亚细胞分辨率下将LSM应用于哺乳动物组织。在哺乳动物中以亚细胞分辨率和低光子剂量进行长期,高速成像仍然是一个挑战。


在各种形式的平行体积成像中,光场显微镜(LFM)通过同时对整个体积进行成像提供了最有效的光子解决方案。受益于高速3D成像和紧凑型系统,LFM在大规模神经记录中取得了巨大成功。但是,即使使用高级算法和方案,其空间分辨率和角分辨率之间的内在折衷通常将其分辨率保持在1μm左右,这对于亚细胞结构来说还远远不够,并且限制了细胞生物学的广泛应用。


在这里,该研究提出了一个框架,称为数字AO扫描LF互斥层析成像(DAOSLIMIT),通过利用超大规模时空分辨率和数十万个时间点,以超高的时空分辨率和低光毒性实现像差校正的3D荧光成像。该研究开发了一种紧凑型扫描LFM(sLFM)系统,该系统具有图像平面的周期性漂移,以接近衍射极限的分辨率和全光子效率收集四维(4D)空间角光分布。除了进行各种定量评估和比较外,该研究还展示了其在多种物种(包括果蝇幼虫,斑马鱼和小鼠)中对细胞生物学和神经科学的效用。


文章来源: 枫叶,清华大学

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