CRISPR相关蛋白(Cas)和其他靶向核酸酶彻底改变了我们操作基因组的能力,但是在靶向双链断裂时外源DNA的精确敲入(KI)仍然很困难。成功的KI既需要通过靶向核酸内切酶进行有效切割,又需要募集内源性DNA修复因子,以将所需编辑整合到宿主基因组中。然而,尽管在基因组上有针对性地断裂的能力已经获得了许多改进,但是目前对如何利用内源性DNA修复蛋白来促进成功的KI的理解仍然是不完整的。


2021年5月26日,麻省理工学院冯国平院士团队在Cell 在线发表题为“Efficient embryonic homozygous gene conversion via RAD51-enhanced interhomolog repair”的研究论文,该研究发现链交换蛋白RAD51可通过同源间修复(IHR)机制显著增加小鼠胚胎中Cas9介导的纯合敲除。


IHR是减数分裂的标志,但仅在体细胞中以低频率发生,而其在受精卵中的发生是有争议的。使用多种方法,该研究提供了可以通过RAD51增强的早期胚胎中内源性IHR机制的证据。可以利用该过程利用外源供体从野生型合子产生纯合子,并将杂合等位基因转化为无外源模板的纯合等位基因。总之,该研究发现显示了IHR在小鼠胚胎中的确凿证据,并描述了增强基因转化的有效方法。


MIT发现同源间修复机制显著增加小鼠胚胎中Cas9介导的纯合敲除


CRISPR相关蛋白(Cas)和其他靶向核酸酶彻底改变了我们操作基因组的能力,但是在靶向双链断裂时外源DNA的精确敲入(KI)仍然很困难。成功的KI既需要通过靶向核酸内切酶进行有效切割,又需要募集内源性DNA修复因子,以将所需编辑整合到宿主基因组中。然而,尽管在基因组上有针对性地断裂的能力已经获得了许多改进,但是目前对如何利用内源性DNA修复蛋白来促进成功的KI的理解仍然是不完整的。


增强KI效率的尝试主要集中在三种不同的方法上:抑制非同源末端连接,促进末端切除,增强同源性搜索和链交换。


尽管通过抑制NHEJ促进蛋白53BP1抑制非同源末端连接(NHEJ)的方法取得了令人鼓舞的结果,但其机制及其对同源重组的直接影响还不清楚。促进端部切除的其他方法被认为是迈向同源重组的决定性步骤,但效果不佳,并建议有必要靶向其他分子,加深对末端切除及其后果的了解。


鉴于NHEJ抑制的潜在危险以及对末端切除及其促进HR的能力了解不足,直接靶向同源重组机制是增强KI的诱人方法。2016年,一项针对兔胚胎的研究表明,使用RS-1可以显著增强KI。KI-1是链交换因子RAD51的化学激动剂,这是一种对HR至关重要的链交换蛋白。在缺乏DNA损伤的细胞中,RAD51会形成小的,无酶活性的七聚体环。响应双链断裂(DSB),蛋白BCCIP促进BRCA2介导的RAD51自缔合的破坏,使RAD51募集至切除的DSB。RAD51随后在末端切除产生的单链突出端上形成长核丝,并积极进行同源搜索和链入侵步骤,这些步骤是同源重组的基础。有针对性的双链断裂增强了RAD51在HR和KI事件中的核心作用,将RAD51与Cas9融合抑制了HDR。


MIT发现同源间修复机制显著增加小鼠胚胎中Cas9介导的纯合敲除


文章模式图(图源自Cell )


基于上述发现以及RAD51在同源重组中的关键作用,该研究试图进一步探索RAD51在基于Cas9的KI事件中的实用性。出乎意料的是,该研究发现RAD51可以通过增强同源间修复(IHR)来增加纯合性。


在使用单链寡核苷酸供体的KI实验中显示出增加的纯合性之后,该研究证明了在不使用供体DNA模板的情况下,在不同染色体上多个位点的频繁纯合转化。然后,该研究确定了可以增强IHR的其他因素,包括能够实现几乎无indel IHR的RAD51变异体,并描述了IHR事件的机制特性。总而言之,该研究为小鼠早期胚胎中的IHR提供了确凿的证据,并表明RAD51和同源重组相关因子可用于增强有效纯合KI和无模板等位基因向纯合等位基因的无模板转化过程。


文章来源: 枫叶, iNature

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