2020年11月27日消息,四川大学赵长生团队设计了Janus引导骨再生膜(JGM)并通过有序分层的电纺技术制造。


负载羟基磷灰石(HAP)的无规明胶纤维被设计为内表面,以促进成骨细胞的粘附,增殖和成骨分化,同时负载聚(甲基丙烯酰氧基乙基三甲基氯化铵-co-2-氨基丙烯酸2-甲基丙烯酸酯盐酸盐)(P(DMC-AMA))的取向聚己内酯(PCL)纳米纤维作为外层,用于抵抗上皮细胞入侵和细菌感染。体外实验显示,内表面显示出增强的成骨作用,同时外表面可调节上皮细胞沿对齐方向扩散并杀死接触的细菌。


有趣的是,外表面可以诱导巨噬细胞向M2型极化,从而保证了良好的骨免疫环境。这些结果表明,JGM可以同时满足屏障,成骨,抗菌和骨免疫调节功能等关键要求。因此,与商用的Bio-Gide膜相比,JGM在体内的骨组织再生性能更好。这项工作为设计多功能膜/支架提供了一个新颖的平台,在组织工程中显示出巨大的应用潜力。该研究以题为“A hierarchical Janus nanofibrous membrane combining direct osteogenesis and osteoimmunomodulatory functions for advanced bone regeneration”的论文发表在最新一期《Advanced Functional Materials》上。


川大研制新型骨再生膜:可抗菌,还可进行免疫调节


【Janus纳米纤维膜的设计和屏障功能】


Janus的设计已被广泛应用于设计先进的生物医学设备,例如用于处理原发性痛经疼痛的Janus微乳剂和用于水回收的Janus分离膜,这为设计理想的GBRM提供了一种选择。Janus结构的主要优点在于可以不对称地调整每个面的形态结构,组成和生物活性从而优化膜的整体性能。在本研究中,Janus被用于通过连续的分层电纺丝来制备理想的GBRM。散乱分布装载HAP的明胶(GEL)纳米纤维作为内表面提高了细胞的亲和力和骨传导性,同时,与软组织接触的外表面由聚己内酯(PCL)纳米纤维组成,提高了机械强度。


同时构造了两个功能面之间的内部分层结构,以避免分层的发生:从内表面到外表面,GEL的含量逐渐减少,而PCL的含量逐渐增加。取向的纳米纤维结构可以调节上皮细胞沿排列的方向扩散,而不是渗透生长。因此,外层将取向的PCL纳米纤维对齐堆叠,以改善膜的阻隔功能。考虑到植入的持久过程和复杂的应用环境,合成了季铵盐聚(甲基丙烯酰氧基乙基三甲基氯化铵-2-甲基-2-氨基乙基丙烯酸2-甲基丙烯酸乙酯盐酸盐)并掺入PCL纳米纤维中以赋予其具有长期抗菌能力的膜,对比组为JGMC(未加入HAP和(P(DMC-AMA)))。


通过分析细胞的增殖和形态,研究了P(DMC-AMA)含量和取向的纳米纤维结构作为外表面对L929细胞行为的影响。结果表明在JGM表面黏附有很多细胞,并且随着时间的推移持续细胞不断增殖,这表明JGM无细胞毒性。此外,本文也研究了外表面是散乱分布的的JGM-R作为对比。CCK-8测试结果表明细胞在取向的JGM上的增殖比在JGM-R上快,表明排列的纳米纤维结构对L929细胞增殖更有利。


粘附在JGM外表面的细胞显示出定向的沿纤维纵向的纺锤状形态,具有比JGM-R更大的宽高比。此外,经过长期培养,细胞会沿着JGM表面上的方向而不是渗透到膜的内部。激光共聚焦结果也证实了这一结论,可以看到细胞只在JGM的表面增殖而不会渗透到膜的内部。


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图1 分层Janus纳米纤维膜制备流程图以及外观和机械性能

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图2 JGM的生物相容性能和屏障功能


【Janus纳米纤维膜的成骨功能、抗菌性能和骨免疫调节功能】


首先,作者研究了JGM的内表面的成骨性能,将MC3T3-E1细胞接种到膜的内表面,评价其增殖,形态和成骨相关蛋白表达水平。CCK-8测试结果表明,所有组中的细胞均持续增殖,并且在每个时间间隔,JGM组的细胞数量均大于JGMC的细胞数量。JGM上的细胞显示出许多单向性片状脂膜渗出,表明细胞在内表面上分布良好。这些结果表明,JGM可以支持成骨细胞的粘附和增殖。紧接着,作者评估了膜上MC3T3-E1细胞的成骨分化性能:碱性磷酸酶(ALP:一种早期成骨标记)的活性和骨钙素(OCN:一种后期成骨标记物)的表达以及细胞外基质(ECM)的矿化作用,结果表明JGM可以促进MC3T3-E1细胞的成骨分化,这归因于从膜释放的Ca2+和PO43-。为了检验JGM支持细胞3D生长的能力,我们随后将MC3T3-E1细胞接种到用细胞冠密封的膜上,并评估细胞向膜中的渗透。在培养过程中,JGM不断增殖,深度随时间增加,表明明胶纳米纤维可以支持成骨细胞向内生长。总之,这些结果表明,JGM的内表面能够增强成骨细胞的粘附,增殖和成骨分化。


其次,作者也研究了JGM的抗菌性能。尽管GBR技术的应用取得了进步,但是细菌引起的感染仍然是骨骼愈合的主要问题。解决此问题的有效方法是赋予GBR膜长期的抗菌能力。在本研究中,作者专门合成了P(DMC-AMA)并掺入JGM的外表面以赋予其长期的抗菌功能,并选择不含P(DMC-AMA)的JGMC作为对照。金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性)和大肠杆菌(革兰氏阴性)被选择用于评估膜的抗菌功能。首先,将膜与金黄色葡萄球菌或大肠杆菌分别培养3、6和12小时,并使用CFU计数方法评估其抗菌效率,结果表明,与JGM共培养的两种细菌的存活率均随着培养时间的延长而呈下降趋势,而与JGMC共培养的细菌的存活率始终高于100%。培养6 h后,与JGM共培养的金黄色葡萄球菌的细菌生存力为0.1%,这表明JGM具有强大的杀菌功能。此外,在JGM的外表面培养的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌活死染色荧光图片也证明了该结论。在这项研究中,JGM的杀菌功能取决于P(DMC-AMA)中的季铵盐(QAS)基团,它们通过交联固定在JGM的外表面上。当细菌接触到JGM的外表面时,QAS组会扰乱细菌膜上的电荷分布,从而改善膜的渗透性,从而导致细菌死亡。因此,JGM的外表面可以遮盖软组织和细菌的入侵,并为新骨的形成提供保证。


最后,作者研究了JGM的骨免疫调节功能。RT-PCR数据显示,JGM的外表面可刺激巨噬细胞转变为M2表型,从而导致抗炎细胞因子的分泌增多,促进愈合的细胞因子。为了进一步研究JGM的骨免疫调节作用,作者收集了巨噬细胞的条件培养基来培养hBMSC,并通过RT-PCR检测成骨相关基因的表达水平,培养7天后,hBMSC表达了最高水平的ALP与其他群体相比。BMP2基因表达也略高于JGMC和Bio-Gide组。总之,JGM组中的条件培养基对hBMSCs的成骨分化影响最大,表明JGM发挥了最佳的免疫调节成骨作用。


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图3 JGM膜的直接成骨功能

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图4 JGM膜的抗菌性能

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图5 骨免疫调节功能的评估


【Janus纳米纤维膜体内动物实验评估】


接着,作者对JGM进行体内动物实验评估。用家兔的颅骨临界大小缺损模型评估JGM的体内骨再生能力,并选择商业化的Bio-Gide膜(已成为骨再生的黄金临床标准)进行比较。在兔子颅骨上形成了直径为8 mm的圆形缺损,然后用骨粉(Bio-Oss)填充,然后用膜覆盖缺损(将没有任何膜的缺损设置为控制组)。植入8周后,对于所有被JGM膜覆盖的组,缺损处均充有大量的再生骨,而对照组则留有明显的缺损腔,而3D重建显示该腔中充满了软组织。新形成的骨头均匀地分布在膜覆盖组的缺损上,而对照组的缺损边缘周围仅产生少量新骨头,表明这些膜不仅起到屏障的作用,而且还显示出骨传导功能。


JGM组的最高骨体积为69.18±7.28%,其次是Bio-Gide组的51.89±8.63%,对照组为22.05±3.95%。另外,与Bio-Gide组相比,JGM组显示出更大的小梁厚度和较小的小梁间距。这些结果表明,JGM具有比Bio-Gide膜更好的骨修复性能。


为了进一步研究膜的骨修复能力,通过H&E染色和Masson染色对新形成的骨骼进行组织学分析。对于Bio-Gide组,缺损主要由新形成的胶原纤维填充,这是决定小梁形成方向的小梁前支架,相比之下,在JGM的缺损区域内观察到更多的小梁和成熟的骨髓腔组。这些结果证实,JGM比Bio-Gide膜促进了更好的骨修复。生物材料植入体内后,立即触发免疫反应。免疫过度反应将在生物材料周围形成厚厚的纤维包囊,从而损害其生物性能。在这项研究中,我们通过皮下植入研究了JGM的体内生物相容性,并选择PCL纳米纤维膜作为对照。将纳米纤维膜植入大鼠背部的皮肤和肌肉之间,植入8周后,切片用H&E染色,可以看到堆积在纯PCL纳米纤维膜周围的单核细胞数量远大于JGM。此外,在JGM组中观察到较薄的纤维包囊,表明具有相对抗炎作用。


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图6 体内骨修复动物实验

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图7 颅骨缺损的组织学分析图


总结:作者通过有序分层电纺制备了一种新型的Janus引导的骨再生膜,结果表明,该Janus系统可以将成骨,抗菌和骨免疫调节功能结合到一个膜中。JGM的内表面促进了成骨细胞的直接成骨分化,JGM的外表面防止了软组织的侵入并保护了骨缺损免于细菌感染。除了对成骨细胞有直接作用外,我们还进一步证明,该外表面通过调节免疫微环境改善了hBMSC的成骨分化。颅骨缺损实验证实,JGM在体内具有优异的骨骼再生性能。总之,本研究为设计用于骨骼再生的医疗器械提供了新策略。


研究背景


引导骨再生(GBR)技术已越来越多地用作牙周或骨缺损治疗的标准程序。作为GBR程序的关键医疗器械,可生物降解GBR膜(GBRM)的优势在于其市场优势:无需进行二次手术就可以去除,这种膜要么基于聚酯,要么来源于组织胶原蛋白。


对于聚酯基合成膜,可控的降解速率和足够的机械强度有利于保持稳定的空间以使骨骼组织成功再生,但是不良的细胞反应和降解产物可能会损害膜的再生性能,然而,尽管以胶原为基的天然膜显示出优异的生物相容性,但较快的降解速度和较差的机械强度可能会导致膜塌陷,损害再生效果。此外,目前市售的GBRM仅设计用于通过阻止成纤维细胞向组织缺损部位的向内生长来执行其屏障功能,而这种作用具有有限的生物活性和再生潜力。


文章来源: 高分子科学前沿

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