近日,美国宾夕法尼亚大学Kavitha Sarma和Roberto Bonasio团队(共同一作为Qingqing Yang和Emily Shields)在Cell Reports上发表文章Mapping Native R-Loops Genome-wide Using a Targeted Nuclease Approach,开发了一种高效检测R-loop的方法——MapR。


宾夕法尼亚大学开发了一种更精确高效检测R-loop的方法


Mapping R-loops (MapR)是一种依赖于RNaseH,并结合CUT&RUN技术来检测基因组中R-loop的方法。在MapR中,失去了催化功能的RNaseH能够结合R-loop,进而利用融合蛋白中的微球菌核酸酶MNase对核酸链进行切割,释放包含有R-loop结构的核酸序列。MapR过程如下图所示,首先将细胞结合到concanavalin A beads上(step1);然后加入失去催化活性的RNaseH 与MNase的结合蛋白(RH∆-MNase),钙离子缺失时,MNase不会发生催化反应(step2);加入钙离子,激活MNase活性, MNase会在RH∆结合位点两端对核酸进行切割,30分钟后加入EGTA和EDTA终止反应(step3);核酸片段从细胞核内释放并回收纯化(step4,step5),进行高通量测序。


宾夕法尼亚大学开发了一种更精确高效检测R-loop的方法


相对于其它检测R-loop的方法,MapR具有以下几个特点:1)MapR的整个实验过程是在细胞内,并且利用MNase对核酸序列进行切割,能够检测到一些相对弱的或是瞬时形成的R-loop;2)MapR不依赖S9.6抗体,不需要构建稳定表达RNaseH的细胞系,整个实验过程只需要一天时间,并且适用于不同的细胞类型;3)MapR技术也可以在少量细胞有效的检测到R-loop,因此可以用来检测人类某些疾病细胞中R-loop的变化。


目前MapR的方法是利用双链DNA建库测序,不能明确的区分DNA:RNA杂合双链中的DNA是正链或负链,在以后的研究中将会通过单链DNA或者RNA建库解决链特异性问题。


背景


R-loop是生物体在转录过程中形成的特殊的三链核酸结构,转录过程中新合成的RNA链与模板DNA链互补配对,形成的DNA:RNA杂合双链与非模板DNA链一起被称为R-loop。R-loop在生物体内普遍存在,并参与了许多生物学过程,例如转录过程、DNA复制、基因组不稳定性以及染色体重排等。


R-loop的异常导致多种人类疾病的发生,包括很多神经以及神经退行性疾病和癌症的形成。因此,对R-loop的形成以及功能方面的研究有助于于我们对疾病的认识。检测R-loop在基因组中的定位是研究R-loop功能首先要解决的问题。


目前,主要有两种检测R-loop基因组定位的方法。第一种方法依赖于S9.6抗体,S9.6能够识别DNA:RNA杂合双链,这类方法包括DNA:RNA immunoprecipitation (DRIP),以及基于DRIP的改进的方法:bis-DRIP,S1-DRIP和RDIP。这类方法应用比较广泛,但实验操作比较剧烈,会损伤一些相对弱的R-loop,并且研究发现S9.6能够结合双链RNA。另外一种方法是依赖于RNaseH,RNaseH能够识别DNA:RNA杂合双链。这类方法包括DNA:RNA in vitro enrichment (DRIVE)和R-loop chromatin immunoprecipitation (R-ChIP)。R-ChIP需要首先获得稳定表达RNaseH的细胞系,这在很多疾病细胞中并不容易获得,因此解决这些问题并开发精确高效的R-loop检测方法非常重要。


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