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张锋发现基于CRISPR相关转座酶实现DNA高效定向插入

文章来源: 医麦客       发布时间:2019-06-12

近日,Broad研究所、麻省理工学院McGovern脑研究所的张锋教授与其同事在Science 在线发表了题为“RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associated transposases”的研究论文。该研究表征了来自蓝细菌Scytonema hofmanni的CRISPR相关转座酶(CAST),实现了新型高效的DNA定向插入。


ShCAST由Tn7样转座酶亚基和V-K CRISPR效应物(Cas12k)组成。在研究中,ShCAST在PAM位点下游60-66bp处定向插入DNA片段,而且该过程是RNA指导的DNA转座。 研究结果显示,ShCAST将DNA整合到大肠杆菌基因组中的特定位点,编辑效率高达80%,无需正选择。


张锋发现基于CRISPR相关转座酶实现DNA高效定向插入


▲ RNA指导的DNA转座模型


总之,这项工作反映了CRISPR-Cas系统超出适应性免疫的功能,同时该功能不依赖Cas核酸酶活性,并且在不涉及同源重组途径的前提下提供了靶向插入DNA的策略。


可以说,这项工作扩展了对CRISPR-Cas系统功能多样性的理解,并实现和建立了精确DNA插入,显示出了在真核细胞中令人兴奋的基因组编辑潜力。


资本在基因手术刀上跳舞


得益于这一消息,张锋等人的Editas Medicine公司股票股价迅速拉升。


而大家肯定没有忘记,2018年6月,《Nature Medicine》期刊上发表的两篇论文引起了业内热议,来自知名科研机构瑞典卡洛林斯卡研究所与剑桥诺华生物医学研究院的两个独立团队发现:经过基因编辑成功改造的细胞很可能会成为潜在的癌细胞!


文章研究结果显示,如果抑癌基因p53存在且功能健全,那么CRISPR能够激活p53引发DNA损伤而使细胞死亡,致使基因编辑失败;而成功编辑的存活细胞大多是p53通路功能存在障碍的,存在癌变的风险。也就是说,癌变或者基因编辑失败?


一时间,开发CRIPSR技术的几个公司的股票都下滑了10%左右。


到此,联系以上两篇论文。CRISPR/Cas9和p53的相遇似乎是一段孽缘,似乎只能在失败和癌变中选择其一。


但许多行业专家们指出,这绝非CRISPR基因编辑技术的末日。首先,我们尚未在小鼠实验中看到由于CRISPR基因编辑导致的肿瘤爆发,因此这两篇论文的发现可能在临床上的负面影响有限。此外,这一风险并不是无法解决的。


张锋发现基于CRISPR相关转座酶实现DNA高效定向插入


2018年7月,CRISPR-Cas9基因编辑技术再引争议。发表在《Nature Biotechnology》上的一项研究表明,CRISPR-Cas9技术可能导致广泛的突变和遗传损伤,其对基因组的造成的影响可能被“严重低估”。


在这项研究中,英国威康桑格研究所教授布拉德利领导的课题组首先检验了CRISPR系统在小鼠的胚胎干细胞中,对一条特定基因的编辑能力。和之前我们对CRISPR基因编辑的认知类似,靶向外显子的gRNA取得了非常好的基因敲除效果,效率达59%-97%。


他们意外地发现,靶向内含子的gRNA,基因敲除的效率也不低。其中,离外显子序列较近的一些gRNA,其基因编辑效率也能达到8%-20%。更夸张的是,有两条gRNA靶向的内含子序列,距离最近的外显子有2kb的距离,它们竟也有5%-7%的编辑效率,明显高于负对照。后续的测序结果则发现,尽管这些gRNA靶向的是较远的内含子区域,但该基因的外显子依旧会被删除。


总之,该研究表明,经过CRISPR-Cas9系统编辑后出现了大量的DNA碱基的删除或插入变异,而且其中一些基因与初始编辑点并不相近。


这会导致巨大的影响,例如一些不正常的缺失会沉默那些本来应该活跃的基因,或者激活一些本来应该被关闭的基因(如致癌基因)。这一效应在小鼠的胚胎干细胞、小鼠的造血祖细胞和人源的分化细胞系中,都得到了类似的结果。


这个新闻显然不是基因编辑公司想要听到的消息,特别是在先前的癌症风险警告推动其股价走低之后。在这份报告公布后,各大CRISPR公司的股价亏损还在继续,Editas 下跌了5%,CRISPR Therapeutics下跌7%,Intellia下跌了7%。


处在风口之一的Intellia公司很快就反击了这份报告。该生物技术公司表示,就该报告而言,任何内容都不是新的或特别令人担忧的。这些缺失并不是新发现的,它不太可能只在CRISPR /Cas9技术上发现,也不会显著影响基于CRISPR的疗法的前进道路。


Intellia首席创新官遗传学家Tom Barnes说:“目前,Intellia已经分析了编辑目标和数万个DNA碱基附近的附带损伤,但所有的我们已经介绍过的编辑中还没有看到这些细胞有任何的致癌转化。”


临床研究在探索中前进


Editas由张锋和Jennifer Doudna创立于2013年11月。2018年11月,领先的基因编辑公司Editas Medicine宣布,FDA已接受公司关于EDIT-101药物的IND申请。这是全球第一个在体CRISPR基因组编辑药物用于治疗第10类莱伯氏先天性黑朦疾病。


张锋发现基于CRISPR相关转座酶实现DNA高效定向插入


▲ EDIT-101原理图(图片来源:editas medicine)


EDIT-101是Editas和艾尔建(Allergan)公司合作开发的基于CRISPR基因编辑技术的在研疗法。本质是装载有CRISPR-Cas9蛋白及两个sgRNA的AAV病毒。通过视网膜下注射直接注射到患者感光细胞附近,将基因编辑系统递送到感光细胞中。当感光细胞表达基因编辑系统时,gRNA指导的基因编辑可以消除或逆转CEP290基因上致病的IVS26突变,从而改善感光细胞功能,为患者带来临床益处。适用于CEP290 (c.2991+1655A> G) 内含子双等位基因突变的莱伯氏先天性黑朦10型(LCA10)患者。


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