日本汽车后视镜项目欲寻找合作伙伴落户中国

酒精-沼气双发酵耦联工艺对酒精发酵效果影响的机理

2018-07-11 15:27:11     来源:食品与发酵工业杂志

摘要在酒精-沼气双发酵耦联工艺中,将沼液和酒糟的混合水回用于酒精发酵过程,不仅可为酒精发酵提供氮源,减少外源氮源添加,还可以降低代谢副产物甘油的生成,提高酒精产率。经分析,乙酸铵是混合水中主要的氮源物质。文中比较了乙酸铵与硫酸铵、氯化铵2种氮源物质对酒精发酵的影响,以揭示酒精-沼气双发酵耦联工艺对酒精发酵效果影响的机理。结果表明,相较于其他2种氮源,乙酸铵为氮源时,酒精发酵时间最短、乙醇产率最高、副产物甘油产量最低。这说明酒精-沼气双发酵耦联工艺中混合水中的乙酸铵是提高酒精产率的主要原因。进一步的研究表明,乙酸铵作为氮源对酒精发酵的正面影响的主要原因在于乙酸铵中乙酸根的存在。


酒精是我国大宗发酵产品之一,2020年年产将达到1 000万t[1]。但是废水污染问题变得更加严重,已经成为限制酒精工业发展的重要因素。以木薯酒精生产工艺为例,其废液处理工艺比较复杂,步骤多、投资大,运行和维护费用高,还需进入城市污水处理系统做深度处理。江南大学毛忠贵教授团队于2006年提出的“酒精-沼气双发酵耦联工艺”诠释了一条全新的解决思路[2-3]。


在该工艺中(图1),木薯原料中的淀粉经过液化、糖化、发酵、蒸馏等技术手段转化为成品酒精,而蒸馏过程产生的70%左右的废水经过厌氧消化(沼气发酵)转化为生物质能源——沼气,沼气发酵后的沼液经过水资源化处理,达到资源化指标后与30%的酒糟(酒糟,主要成分为木薯原料中不能被酵母菌利用的纤维素、半纤维素、果胶等生物质,酿酒酵母代谢主要副产物,如小分子有机酸、甘油、异戊醇,以及杂菌产生的乙酸、乳酸、丙酸等)清液混合,回用作为工艺用水,实现废水零排放目标;沼气替代煤炭作为能源物质,通过“热电联产”技术获得绿色能源,回供于生产中的各个工序。该工艺相较于传统工艺具有显著优势:(1)削除了占地面积大、运行费用高的好氧消化处理;(2)消除了污水深度处理费用;(3)实现废水回用,节约大量水资源;(4)原料利用率提高约2%;(5)可消除发酵过程外观氮源(如尿素)的添加,进一步降低辅料成本。


经过分析发现,乙酸铵是混合水中主要的氮源物质。本研究通过比较乙酸铵与硫酸铵、氯化铵2种氮源物质对酒精发酵的影响,揭示了酒精-沼气双发酵耦联工艺对酒精发酵效果影响的机理。

酒精-沼气双发酵耦联工艺对酒精发酵效果影响的机理



1材料与方法


1.1材料


酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae):湖北宜昌安琪酵母有限公司;木薯:吴江永祥酒精制造有限公司;耐高温α-淀粉酶(100 000 U/mL)和糖化酶(10 000 U/mL):无锡杰能科公司。


1.2方法


1.2.1种子培养基(g/L)


葡萄糖20,酵母膏8.5,NH4Cl 1.3,MgSO4·7H2O 0.1,CaCl2 0.06,pH自然,115℃灭菌15 min。


1.2.2液化液制备与酒精发酵


按1∶3(g∶mL)的比例将木薯粉(平均粒径0.45 mm)与配料水混合,加入耐高温α-淀粉酶(15 U/g木薯粉)。加热料液至90℃,维持100 min。自然降温到室温,用去离子水弥补液化过程损失的水分。分装至250 mL三角瓶中,灭菌(115℃,15 min)。降温到室温,在超净台添加糖化酶(150 U/g木薯粉)、种子培养基[φ(种子液)=10%]和氮源(含氮质量浓度400 mg/L)进行酒精发酵。在30℃培养箱中静置。


1.2.3上罐酒精发酵


分批发酵在工作体积为3 L的5 L罐发酵罐(Baoxing Corp,China)中进行。将约300 mL的预培养种子接种到2.7 L无菌发酵培养基中。培养期间通过pH电极(Mettler Toledo)检测pH变化,发酵温度30℃。接种后每隔2 h取样检测,间歇搅拌。首先,分别以乙酸铵和硫酸铵作为氮源,进行酒精发酵,发酵过程不调控pH;然后再以硫酸铵为氮源,调控发酵过程pH,使之与乙酸铵为氮源时pH变化趋势一致。


1.2.4分析方法


总糖测定:斐林试剂滴定法[4]。


酒精浓度测定:蒸馏法[5]。


甘油测定:HPLC法。色谱条件:Aminex HPX-87H色谱柱(300 mm×7.8 mm,9μm,Hercules,CA);RI检测器(Shodex RI-101,Japan)和UV检测器(Dionex,USA);流动相为5 mmol/L H2SO4;柱温65℃;流速0.6 mL/min;进样量20μL。


酵母细胞数测定:血球板计数法。


采用SPSS Statistics 19(IBM,USA)进行方差分析(Fisher’s least significant difference,LSD),当p<0.05时认为差异显著。


2结果与讨论


2.1不同氮源对木薯酒精发酵效果的影响


在酒精发酵过程中,每产生1分子乙醇就伴随着1分子CO2的产生,因此可以通过酒精发酵过程发酵体系的失重情况来直接反映酒精发酵速率,并且可间接反映酒精产率。从发酵失重曲线来看(图2-a),当以乙酸铵为氮源时,在39 h时,发酵体系失重不再增加,说明此时酒精发酵已结束;而以硫酸铵和氯化铵分别为氮源时,酒精发酵延迟到48 h才结束。这说明以乙酸铵为氮源的酒精发酵速率明显高于以硫酸铵和氯化铵分别为氮源的酒精发酵。此外,以乙酸铵为氮源的酒精发酵的总失重也明显高于以硫酸铵和氯化铵分别为氮源的酒精发酵,间接表明乙酸铵可以提高酒精发酵的酒精产率。此外,相较于硫酸铵和氯化铵(pH 3.6),乙酸铵作为氮源时发酵结束后发酵液pH也维持在相对较高的水平(4.20)(图2-b)。与此相反,当以乙酸铵为氮源时残总糖浓度相对较低(图2-d)。由于培养基中含有的木薯渣,酵母的干重很难测量,因此使用血细胞计数器来计数酵母细胞以评估酿酒酵母的生长。图2-c的结果表明当使用乙酸铵作为氮源时,获得较低的生物量,这与高发酵率是由于高生物量产生的这一理论相悖[6]。

酒精-沼气双发酵耦联工艺对酒精发酵效果影响的机理


如图3-a所示,乙酸铵为氮源时的酒精体积分数比硫酸铵和氯化铵为氮源时的酒精体积分数高4%左右,该结果与总失重结果相一致。不同氮源还会影响酒精发酵过程的最主要副产物甘油的产生。图3-b显示,以硫酸铵和氯化铵为氮源的酒精发酵的甘油产量相似,但比以乙酸铵为氮源的酒精发酵的甘油产量高约24%。

酒精-沼气双发酵耦联工艺对酒精发酵效果影响的机理


根据上述结果初步推测,相较于硫酸铵和氯化铵,乙酸铵通过降低副产物甘油的合成以及发酵残总糖的浓度,使得发酵体系中更多的碳源转化为主产物酒精。那么,乙酸铵是如何降低甘油的合成以及残总糖的浓度则是需要进一步解决的关键科学问题。酒精发酵过程中,酵母产生甘油的目的是用于维持胞内的氧化还原平衡和渗透压平衡,此外当酿酒酵母所处培养基的pH发生变化时,也会影响酿酒酵母对甘油的合成。当氨氮作为氮源时,酵母利用氨氮合成氨基酸,同时生成NADH。为了避免胞内的NAD+/NADH比例失衡,酿酒酵母必须通过甘油产生途径将NADH重新氧化为NAD+[7]。但是,实验所用3种氮源同为铵盐,且浓度相当,所以推测pH是造成2类氮源下甘油合成差异的主要原因。


为了证明这一推测,首先分别监测了乙酸铵、硫酸铵为氮源时,酒精发酵过程pH的变化情况,在此基础上调节硫酸铵为氮源时发酵体系pH,使之与乙酸铵为氮源时pH变化趋势一致,比较两种条件下,酒精发酵效果。如图4-a所示,当硫酸铵作为氮源时,发酵过程pH的下降速度和幅度明显高于以乙酸铵为氮源时的发酵,发酵10 h时pH就下降到最低值pH 3.28,而对于乙酸铵,发酵18 h pH下降到最低值pH 3.94。在酒精发酵过程,发酵液pH的下降主要是由酿酒酵母通过营养传递过程分泌质子、吸收不同的离子、生成CO2和有机酸等过程引起的[8]。当铵盐作为氮源时,酿酒酵母通过等离子膜ATPase产生的电化学等离子膜电势将氨氮从培养基中吸收至胞内,细胞为了保持胞内pH稳定必须将等摩尔质子排至胞外,这就造成发酵液pH的下降[9-10]。硫酸铵和乙酸铵同为铵盐,但是硫酸根为强酸盐,而乙酸根为弱酸盐,发酵过程乙酸盐会与乙酸构成缓冲体系,在乙酸的pKa(4.75)附近产生较强的缓冲作用,致使发酵液pH下降速度和幅度相对较低,而发酵培养基中相对高的pH有利于糖化酶发挥作用,使得残总糖的浓度较低。然而,以硫酸铵为氮源时,即使调节发酵体系pH使之与乙酸铵为氮源时pH变化趋势一致,酒精发酵过程甘油产量不仅没有下降,反而有所升高(图4-b)。这说明硫酸铵为氮源时甘油产量较乙酸铵为氮源时低的现象并不是由较低的发酵pH所引起。

酒精-沼气双发酵耦联工艺对酒精发酵效果影响的机理


2.2乙酸铵中乙酸根对酒精发酵的影响


乙酸铵所带乙酸根除了对酒精发酵过程pH的变化趋势产生影响外,可能也是影响酿酒酵母甘油合成的因素。因此,研究了不同氮源条件下,乙酸添加对于酒精发酵过程的影响。结果显示,当以硫酸铵为氮源时,酒精发酵速率相对较低;而在此基础上添加乙酸则可提高酒精发酵速率(相对于前者发酵时间缩短了约20.83%)并且与乙酸铵为氮源时的发酵速率相当。硫酸铵为氮源时,添加乙酸还会提高发酵结束时pH,进而导致发酵残总糖较硫酸铵为唯一氮源时偏低,但是仍高于以乙酸铵为氮源的酒精发酵,这与上文所述残总糖与发酵pH密切相关的结论一致。另外,向以硫酸铵为氮源的发酵体系中添加乙酸,可显著提高酒精产量并降低甘油产量,并且与以乙酸铵为氮源时的发酵水平相当。上述结果说明,向发酵液中添加乙酸可以提高酿酒酵母酒精发酵效果,与硫酸铵和氯化铵相比,乙酸铵作为氮源对酒精发酵的正面影响主要是原因在于乙酸铵中乙酸根的存在。

酒精-沼气双发酵耦联工艺对酒精发酵效果影响的机理


围绕乙酸对酿酒酵母的影响及酿酒酵母对乙酸的响应机制,国内外学者开展了大量的研究工作,主要得到了如下结论或推论:(1)低pH(<pKa=4.76)条件下,大部分乙酸以未解离状态存在,这些乙酸主要通过细胞膜上Fps1p(一种水-甘油跨膜输送蛋白)介导的协助扩散方式进入酵母细胞[10]。在胞内高pH(接近中性)环境下,乙酸解离为乙酸盐和质子,造成细胞质酸化,从而抑制胞内代谢反应[12]。(2)致死浓度下,乙酸会引起胞内ROS积累,线粒体中细胞色素c释放,线粒体功能紊乱和细胞凋亡蛋白质活力增加,并最终导致细胞死亡(程序性细胞死亡)[13]。(3)细胞质酸化会使得细胞膜上的Pam1p(H-ATPase)表达量上调,在消耗等摩尔ATP的条件下将多余的H+泵出细胞,从而维持胞内pH平衡,恢复细胞正常生长[14]。但是,当乙酸浓度过高时,酵母细胞会保留胞内ATP,而不再恢复生长和胞内pH[15]。(4)低pH环境下,乙酸会激活胞内MAP激酶Hog1p,使得Fps1p磷酸化及后续的泛素化、内吞并最终在液泡中被蛋白酶降解,Fps1p的降解会阻止乙酸进入细胞,减少对细胞的伤害[11]。值得注意的是,Hog1p的激活却伴随着甘油浓度的下降[16]。从这些研究结果可以看出,高浓度乙酸可抑制酿酒酵母的生长,延长酒精发酵周期,并降低酒精产率。而本研究却发现低浓度乙酸却可以提高酒精发酵过程中的酒精产率,且降低甘油产率。那么低浓度和高浓度乙酸压力下,为什么酵母细胞表现出不同的乙醇合成量,酵母细胞代谢调控是如何在低浓度和高浓度乙酸压力间过渡的,乙酸为什么能够降低甘油的生成,是一个非常值得研究的科学问题,也是我们未来将要开展的研究工作。


3结论


酒精-沼气双发酵耦联工艺的应用不仅可为酒精发酵提供足够的氮源,还可提高酒精产率,降低副产物甘油的生成。本文研究表明,回用水中乙酸铵是一种有效的酒精发酵氮源物质,相较于硫酸铵和氯化铵,它可缩短酒精发酵时间、提高酒精产率及减少副产物甘油合成。因此,乙酸铵是造成酒精-沼气双发酵耦联工艺对酒精发酵效果产生正面影响的主要因素。

我来说几句

* 获取验证码
最新评论

还没有人评论哦,抢沙发吧~

为您推荐

单细胞DNA甲基化异质性建立了金标准
单细胞DNA甲基化异质性建立了金标准
09月19日 16:57   DNA甲基化
如何解冻肉(最快)?
如何解冻肉(最快)?
09月19日 14:31   解冻肉
9月29日起全国铁路将停止使用常温链盒饭
09月18日 19:34   常温链盒饭
线粒体自噬调控肝癌发生的新机制
线粒体自噬调控肝癌发生的新机制
09月18日 16:09   线粒体
Nature | 用生物大分子来做模式识别
Nature | 用生物大分子来做模式识别
09月17日 18:44   模式识别
液体饲料添加剂真空后喷涂工艺的研究
液体饲料添加剂真空后喷涂工艺的研究
09月15日 13:03   饲料添加剂
OsDER1:水稻内质网相关蛋白降解新因子
OsDER1:水稻内质网相关蛋白降解新因子
09月14日 16:15   水稻基因
花青苷:苹果着色机理研究进展
花青苷:苹果着色机理研究进展
09月14日 11:29   苹果
中国食品溯源领域的发展趋势
中国食品溯源领域的发展趋势
09月13日 16:36   食品溯源
食品包装计数设备的优点
食品包装计数设备的优点
09月13日 16:30   食品包装设备
大豆驯化改良中的DNA甲基化变异
大豆驯化改良中的DNA甲基化变异
09月13日 16:06   DNA甲基化
习近平和普京一起穿围裙做鱼子酱煎饼
习近平和普京一起穿围裙做鱼子酱煎饼
09月13日 14:16   习近平  普京  鱼子酱煎饼